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biochain Z5030012說(shuō)明書

更新時(shí)間：2020-07-21 點(diǎn)擊次數(shù)：1684

biochain Z5030012說(shuō)明書

Malachite Green Phosphate Assay Kit

孔雀石綠磷酸鹽檢測(cè)試劑盒

總覽

BioChain的孔雀石綠磷酸鹽檢測(cè)試劑盒基于對(duì)孔雀石綠，鉬酸鹽和游離正磷酸鹽之間形成的綠色絡(luò)合物的定量分析。通過(guò)分光光度計(jì)（600 – 660 nm）或酶標(biāo)儀可以方便地測(cè)量反應(yīng)迅速形成的顏色。非放射性比色測(cè)定試劑盒已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可提供出色的靈敏度和更長(zhǎng)的保存期限。該測(cè)定方法簡(jiǎn)單，快速，只需一個(gè)添加步驟即可測(cè)定磷酸鹽。可以在試管，比色皿或多孔板中進(jìn)行測(cè)定。可以在96和384孔板中方便地進(jìn)行測(cè)定，以高通量篩選酶抑制劑。

描述

BioChain的基于細(xì)胞的測(cè)定試劑盒可滿足制藥和生物技術(shù)客戶不斷增長(zhǎng)的需求，這些需求源于從基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)衍生出來(lái)的大量藥物靶標(biāo)。我們的客戶正在尋求在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中進(jìn)行大規(guī)模篩選，因?yàn)闇?zhǔn)確而完整的細(xì)胞數(shù)據(jù)很有希望并可以代表生物的生理狀況。該試劑盒配有用于該測(cè)定的所有試劑的完整系統(tǒng)和易于遵循的方案

孔雀綠磷酸鹽檢測(cè)試劑盒 (Z5030012)

孔雀綠磷酸鹽檢測(cè)試劑盒是基于對(duì)孔雀綠、鉬酸鹽和游離正磷酸鹽之間形成的綠色復(fù)合物進(jìn)行定量。可在分光光度計(jì) (600-660 nm) 或酶標(biāo)儀上方便地測(cè)定反應(yīng)快速顯色。對(duì)非放射性比色測(cè)定試劑盒進(jìn)行了優(yōu)化，以提供*的靈敏度和延長(zhǎng)的有效期。該測(cè)定法簡(jiǎn)單、快速，涉及磷酸鹽測(cè)定的單個(gè)加入步驟。可在試管、比色皿或多孔板中執(zhí)行測(cè)定。該試驗(yàn)可方便地在 96 孔和 384 孔板中進(jìn)行，用于高通量篩選酶抑制劑。

關(guān)鍵特征

試劑非常穩(wěn)定。由于我們的創(chuàng)新配方，不會(huì)發(fā)生試劑沉淀。因此，測(cè)定前無(wú)需過(guò)濾試劑，這是其他市售試劑盒的常見(jiàn)要求。

高靈敏度和寬檢測(cè)范圍：檢測(cè)低至 1.6 pmole 的磷酸鹽，有效范圍為 0.02 M 至 40 M 磷酸鹽。

快速方便：均勻的“混合和測(cè)量”測(cè)定法可在 20 min 內(nèi)定量測(cè)定游離磷酸鹽。

與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室和 HTS 格式兼容：可在試管、比色皿或微孔板、分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定。

在 96 孔和 384 孔板中觀察到穩(wěn)健且適用于 HTS：Z' 因子為 0.7-0.9。可在 HTS 液體處理系統(tǒng)上輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

應(yīng)用

磷酸酶測(cè)定：從肽、蛋白質(zhì)或小分子底物中釋放磷酸鹽。

脂肪酶測(cè)定：從磷脂中釋放磷酸鹽

核苷三磷酸酶測(cè)定：從核苷三磷酸鹽（ATP、GTP、TTP、CTP 等）中釋放磷酸鹽。

磷脂、蛋白質(zhì)和 DNA 等中磷酸鹽的定量

藥物發(fā)現(xiàn)：高通量篩選磷酸酶抑制劑。

試劑盒內(nèi)容物：在 96 孔板中進(jìn)行 2,500 次測(cè)定

試劑 A：50 mL 試劑 B：1 mL 標(biāo)準(zhǔn)品：1 mL 1 mM 磷酸鹽

儲(chǔ)存條件。試劑和標(biāo)準(zhǔn)品在 4 ℃ 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 1 年。

注意事項(xiàng)：試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)，應(yīng)采取實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)預(yù)防措施。詳細(xì)信息請(qǐng)參見(jiàn)材料安全數(shù)據(jù)表。

使用 96 孔板的程序

試劑制備。每次測(cè)定需要 20 L 工作試劑。通過(guò)混合 100 vol 試劑 A 和 1 vol 試劑 B（例如 5 mL 試劑 A 和 50 μL 試劑 B）制備足量的工作試劑。工作試劑在室溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存至少 1 天。

重要提示：使用前必須將試劑恢復(fù)至室溫。每次測(cè)定前，重要的是檢查所有酶制劑和測(cè)定緩沖液中均不含游離磷酸鹽。向 80µL 樣品溶液中加入 20µL 工作試劑可方便地完成該操作。在 620 nm 處的空白 OD 值應(yīng)低于 0.2，如果 OD 讀數(shù)高于 0.2，檢查磷酸水水平。雙蒸水的 OD 讀數(shù)通常低于 0.1。實(shí)驗(yàn)室清潔劑可能含有高水平的磷酸鹽。*清洗后，確保實(shí)驗(yàn)室器具不污染磷酸鹽。

磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品的制備。通過(guò)移取 40 L 1 mM 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于 960 L 蒸餾水或酶反應(yīng)緩沖液中，制備含 40 M 磷酸鹽的預(yù)混溶液。試管編號(hào)。

按下表所示稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。移取 80 L 標(biāo)準(zhǔn)品，一式兩份，置于透明底 96 孔板的孔中。加入僅含水或反應(yīng)緩沖液的空白對(duì)照。

No	預(yù)混劑 + H2O	終體積 (mL)	磷酸鹽濃度 (M)	pmoles 磷酸鹽 in 50 mL
1	200mL + 0mL	200	40	2,000
2	160mL + 40mL	200	32	1,600
3	120mL + 80mL	200	24	1,200
4	80mL + 120mL	200	16	800
5	60mL + 140mL	200	12	600
6	40mL + 160mL	200	8	400
7	20mL + 180mL	200	4	200
8	0mL + 200mL	200	0	0

2. 將 80µL 供試品轉(zhuǎn)移至平板的不同孔中。

注：在酶反應(yīng)的情況下，可通過(guò)加入特定抑制劑終止反應(yīng)，或通過(guò)加入工作試劑直接終止反應(yīng)。試驗(yàn)前可能需要稀釋反應(yīng)混合物（見(jiàn)一般注意事項(xiàng)）。對(duì)于 ATP 酶或 GTP 酶測(cè)定，ATP 或 GTP 濃度應(yīng)低于 0.25 mM，如果反應(yīng)混合物含有 > 0.25 mM 的 ATP 或 GTP，則用蒸餾水稀釋樣品。例如，如果 ATP 酶反應(yīng)含有 1 mM ATP，則在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，在測(cè)定前用水將反應(yīng)混合物稀釋 4 倍。

向各孔中加入 20µL 工作試劑。輕敲微孔板輕輕混勻。

4. 室溫下孵育 30 min，顯色。

5. 在酶標(biāo)儀上測(cè)定 600 nm-660 nm (620 nm) 處的吸光度。

對(duì)于 384 孔板中的測(cè)定，程序相同，只是標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的體積應(yīng)為 40 L，工作試劑的體積應(yīng)為 10 L。

圖。96 孔板磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。孵育 30 min 后，讀取 620 nm 處的 OD。數(shù)據(jù)表示為平均 SD (n = 2)。有效檢測(cè)范圍為 0.02-40 M 磷酸鹽。

一般考慮

孵育時(shí)間。顯色反應(yīng)在室溫下 30 min 內(nèi)完成。在 30 min 時(shí)讀取 OD 值。

在高濃度磷酸鹽 (> 100 M) 或存在高濃度蛋白質(zhì)和金屬（例如）的情況下，可能發(fā)生沉淀。

孔雀綠磷酸鹽檢測(cè)試劑盒

如果發(fā)生沉淀，在 H2O 中對(duì)樣品進(jìn)行系列稀釋，運(yùn)行試驗(yàn)并測(cè)定無(wú)沉淀孔的稀釋因子。使用稀釋樣品重復(fù)測(cè)定。

酶反應(yīng)緩沖液。由于任何外源性游離磷酸鹽均會(huì)干擾試驗(yàn)，因此確保試驗(yàn)中使用的蛋白制備液、反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)室器具不應(yīng)含有游離磷酸鹽非常重要。這可以通過(guò)向緩沖液中加入工作試劑并測(cè)量顏色形成來(lái)方便地檢查。

液體處置。含量測(cè)定混合物含 0.4 M 硫酸。建議在處置前用等體積的 1 NNaOH 中和廢液。

數(shù)據(jù)分析

以 OD620 nm 對(duì)磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品濃度作圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品磷酸鹽濃度。

文獻(xiàn)

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高通量篩選

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蛋白質(zhì)和 DNA 中的磷酸酶、脂肪酶/磷脂、核苷三磷酸酶和磷酸鹽分析

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技術(shù)說(shuō)明

孔雀綠磷酸鹽檢測(cè)試劑盒已經(jīng)過(guò)優(yōu)化和配制，以提供靈敏、方便和穩(wěn)健的定量測(cè)定從酶反應(yīng)和天然來(lái)源中釋放的游離磷酸鹽。試劑盒的關(guān)鍵特征如下：

安全。非放射性試驗(yàn)。

高靈敏度和寬檢測(cè)范圍：僅檢測(cè) 1.6 pmole 磷酸鹽和 0.02 M 至 40 M 磷酸鹽。