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GMP級PEI 大量現貨

更新時間:2022-06-30      點擊次數:1041

 

GMP級PEI 大量現貨

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)

訂購信息

貨號

產品名稱

規格

78EF10003-5Ml

78EF10003-1L

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)

5Ml

1L

 


儲存溫度:2-4保存?年。(避免冷凍

產品描述

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉染試劑,本制品利BIOHUB公司生產的線性陽離子聚合物,按照符合GMP認證管理體系下,采用藥用規格原輔料生產,所用起始材料及所需化學品和配制過程均在無菌環境中操作進行,以確保制造過程中每個步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴格控制重金屬殘留、細菌內毒素殘留等,生產工藝符合 GMP 規范的產品生產與質量管理規程,保障生產過程及所有原輔料可追溯。

 

1.PH值檢測通過中國藥典 2020版第四部 pH 值測定法(通則 0631)

2.檢測遵循《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。

3.檢測遵循USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered 4.Products 用于細胞治療,基因治療和組織工程產品中的輔料。

5.細菌內毒素檢測符合中國藥典2015版四部通則(1143)方法2光度測試法(動態濁度法)

6.重金屬殘留檢測符合國藥典 2020版第四部重金屬檢查法(通則 0821)

7.支原體檢測 使用支原體檢測試劑盒

產品特點

    BIOHUB-PRO GMP在 HEK293CHO大多數表達系統中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩定的高表 達(96 孔板至 100L 生物反應器)。現在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進行細胞轉染.

1.GMP級別定制監管,支持并滿足合規要求。

2.不含動物源性成分。

3.嚴格遵循以下規范生產 1. ISO 9001:2015, certified facility

4.嚴格按照《GMP 附錄-細胞治療產品》國家藥品監督管理局。

5.從工藝開發到臨床試驗和商業化的無縫過渡生產細胞系(HEK-293 和衍生物、VERO 等的*高病毒產量。

6.超高的性價比

 

 

質量信息表

 

操作方法參考

 

一、貼壁細胞轉染 以 6 孔板轉染 293T 細胞為例:

(一)轉染前準備

1) 轉染前一天:用膠原酶 (WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化細胞并計數(不建議用胰酶)。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T6孔板(每孔加入2ml新鮮DMEM:F12+5%FBS *培養基和 1ml 的細胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養箱培24h

2) 24h 后,移除之前培養基,每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS

注意:確保 293T 細胞生長狀態良好傳代 不超過15代。

(二)轉染過程

3) 第一天:顯微鏡下檢查細胞匯合度,當細胞達到 70%80%的匯合度時,開始準備轉染。

4) 對于每孔細胞,用 100µl 無血清培養基(如 OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/mlDNA/總培養體積)。

5) 對于每孔細胞,用100μ無血清培養基(如 OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP DNA:BIOHUB-PRO GMP  的比例要依據自己實驗摸索最適比例。

6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中(總體積 200µL)輕輕混勻, 室溫孵育30分鐘。

7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP復合物滴加到細胞培養板每個孔中,輕輕搖動培養板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入,而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。

8) 將培養板放入 37°C5%CO2培養箱培養中培養 24h

(三)觀察轉染結果 9) 第二天:在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率,通常超過 80%293T 細胞在轉染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉染時應對 BIOHUB-PRO GMP DNA 的比例進行優化,以達到最適比例, 通常篩選范圍在 1:1 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI,用BIOHUB-PRO  GMP時應適當 降低使用濃度。

通常情況下,分別準備BIOHUB-PRO GMP 和DNA轉染溶液時其體積一般是轉染前每孔細胞培 養液體積總量的 1/10-1/20,如細胞培養液體積為 3ml,則稀釋BIOHUB-PRO  GMPIDNA 的體積為150ul。質粒 DNA 的濃度通常為 1ug/mlDNA 質量/細胞培養總體積)[1][4]。 不同質粒種類以及大小會影響轉染效率,如較大片段插入質粒可能轉染效率低,可根據 實際實驗需要調整,如適當增加轉染質粒總量等。 ØHEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打,但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞,如果表達的是膜蛋白,胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達, 建議用膠原酶消化細胞,我們推薦(LS004196WORTHINGTONG)的膠原酶。 對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養基和78BioPEI GMPDNA 的最佳比例,就可以在轉染后 24 96 小時內多次觀察轉染效率,以優化最大表達量時間點。

二、懸浮細胞轉染 離心對數期生長的細胞用新鮮的培養基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規模轉 染時,如需大規模轉染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL,可參考文獻[4]。以 293F 細胞 于 100mL 培養瓶(溶液體積占瓶體積的 1/5)操作體系舉例如下:

(一)轉染前準備

 1) HEK293F 細胞傳代接種于 20mL 懸浮細胞生長培養基中(36.5℃,120rpm5%CO2 )的條 件下培養。當細胞密度到 1X10 6cells/mL,然后旋緊瓶口放入搖床繼續培養,2~4 小時 后可以進行轉染。

(二)轉染過程

 2) 用 1mlOptiPROSFM(無血清培養基)稀釋適量的 DNA,使 DNA 終濃度為 1ug/mlDNA/總 培養體積)。混勻并靜置 5min

 3) 用1mlOptiPROSFM(無血清培養基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP,混勻并靜置 10min

(78BioPEI:DNA 參考比例范圍,可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO GMPDNA 優化方案優化)。

 4) 將BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。

 5) 將BIOHUB-PRO GMP轉染復合物逐滴加入到細胞培養液中,搖勻后旋緊瓶口放回搖床 (36.5℃,5%CO2,120rpm)。

 6) 基因表達可在 24-72 小時后檢測,具體時間取決于細胞系和轉基因.

 

小貼士

在懸浮培養中,單個細胞的轉染效率要高于聚集在一起的細胞,需要優化適合單細胞的 生長條件。 方形瓶應經過兩個連續的干燥循環高壓滅菌(每個 45 分鐘,干燥 15 分鐘) 蓋子應盡可能松,不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前,將其*放入層流罩中。如果瓶子向內塌陷,細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產量,有參考文獻表明轉染后 24 小時,可以適當稀釋細胞,稀釋比例參考范圍(1:21:5)之間,可以增加蛋白產量,稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據經驗確定, 可以把 DNA BIOHUB-PRO  GMP 轉染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉染,但必須經過上述 特定流程的 DNA 和轉染試劑的比例和用量的相應優化。

注意事項

1.不同質粒種類以及大小會影響轉染效率,可如較大片段插入質粒可能轉染效率低,可根據實際實驗需要調整,如適當增加轉染質粒總量等。

2.細胞狀態及代數會較大程度影響轉染。剛復蘇細胞需傳代2-3次以上,待細胞生長穩定后做轉染實驗。為保證實驗穩定性,轉染細胞盡量選擇20代以內進行實驗。

3.對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。

初次使用應優化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉染效率。

4.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

 

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