質譜級賴氨酰肽鏈內切酶

Lysyl Endopeptidase

本產品是質譜分析前處理時常用的蛋白分解酶即賴氨酰肽鏈內切酶，該酶可以特異性切除賴氨酸基團C末端的多肽，可用于蛋白測序分析和Lys-X化合物的酶合成。若同時使用賴氨酰肽鏈內切酶和胰酶，可更好地切斷賴氨酸 基團的多肽，增加多肽的數量。產品已按照使用習慣做成小包裝，是方便使用的冷凍干燥品。

來源：細菌

外觀：凍干粉（包含2mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8）

活性：0.03～0.07AU/vial

分子量：27,000(瓊脂糖過濾)，30,000（SDS-PAGE）

溶解性：溶于水或緩沖液

穩定性：溶解于pH值5.0-12.0的Tris緩沖液中，可在4℃穩定保存2年；在pH值6.0-11.0 30℃時能穩定保存，但溫度超過50℃時不穩定。

最適pH值:9.0~9.5

等電點：6.9~7.0 

底物特異性：

可水解底物——Tos-Lys-OMe,Bz-Lys-NH2,Bz-Lys-pNA,Lys-pNA

不可水解底物——Bz-Arg-NH2,Bz-Arg-pNA,Arg-pNA

抑制劑：DFP，PMSF，TLCK

◆特點

●  高特異性、高蛋白質消化率、適用于蛋白質譜分析

●  提高裂解效率、增加肽段數量

●  根據使用量特意制備小包裝，方便使用

◆應用

分別采用胰蛋白酶(Tp)、賴氨酰肽鏈內切酶(Lep) 和Tp與Lep聯用進行膠內酶切的效果比較。

牛血清蛋白BSA 的條帶(100ng) 通過SDS-PAGE 獲得，然后分別用Tp、Lep和Lep+Tp進行酶切，再用MALDI-TOFMS法進行分析。

這些蛋白酶的實驗效果見下表。

表 1：Tp、Lep和Lep+Tp的結果對照

這些結果表明Lep酶解的錯誤裂解率低。Tp酶解時加入Lep后，錯誤裂解率有所降低，同時，可以鑒定出更多的多肽。

胰蛋白酶 (Tp)( 圖 a) 和賴氨酰肽鏈內切酶 (Lep)+Tp ( 圖 b) 酶切后的質譜結果對照圖。

Lep+Tp酶切后，可以在m/z=2000時得到吸收峰，而單獨的Tp酶切在m/z=2000時沒有吸收峰。該結果表明Lep可以提高測序覆蓋度。

( 數據由大阪醫療中心和婦嬰健康研究所Y. Wada博士提供 )

賴氨酰肽鏈內切酶

賴氨酰肽鏈內切酶，最初由Masaki 等人從土壤細菌中分離得到。該酶可以特異性剪切賴氨酸殘基C 末端和S-氨乙基半胱氨酸殘基的肽鍵，用于蛋白測序和Lys-X 化合物的酶催化合成。該酶穩定性高，在4M 尿素或0.1%SDS 溶液中30℃孵育6小時之后，仍然擁有完整的生物活性。

實驗方法：

1. 試劑：

A．0.2 mol/L AMP 緩沖液，pH值9.5

溶解4.2g的2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇于150 mL的水中，加入1 mol/L HCl調pH值至9.5，再加水使體積至200 mL。

B．2.5 mmol/L 底物溶液

溶解22.6 mg的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽于20 mL水中。

C.  2 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8

溶解0.24 mg的2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇于900mL水中，加入0.1 mol/L HCl調pH值至8，再加水使體積至1L。

D. 酶溶液

溶解1vial的賴氨酰肽鏈內切酶于1 mL的溶劑C中，可直接加入。

E．終止溶液

將55 mL水和45 mL乙酸混合均勻。

2. 步驟

3. 單位的定義

酰胺酶單位是指30℃ pH9.5時，每分鐘產生1 umol對硝基苯胺的酶量。

AU/vial = [(a-b) / 25] × (1 / 9.62) × (4.0 / 0.1)

a.    檢測樣品中的吸光度

b.    空白對照中的吸光度

膠內酶切的實驗操作流程

用聚硅酮處理的微量離心管和吸管端防止捕獲任何蛋白。使用質譜分析用凝膠染色試劑盒，例如銀染劑MS試劑盒（產品編號：299-58901）和負凝膠染色MS試劑盒（產品編號：293-57701）

1.    電泳分離蛋白質樣品；

2.    從凝膠中切割蛋白質片斷并放入微量離心管；

3.    使凝膠脫色（可使用質譜分析用凝膠染色試劑盒中的脫色溶液）；

4.    加入300 uL乙腈到試管里，攪拌器振蕩30分鐘；

5.    去除乙腈，用Parafilm膜覆蓋微量離心管。

6.    在Parafilm膜上打出針孔，真空干燥15分鐘；

7.    100 uL 10 mmol/L DTT溶解于100 mmol/L 碳酸氫銨，56℃恒溫1小時。

8.    室溫冷卻后，用等量的50mM碘乙酰胺溶解于100 mmol/L 碳酸氫銨，暗處恒溫45分鐘并渦旋；

9.    用100 uL 100 mmol/L碳酸氫銨洗滌凝膠片段10分鐘；

10.  用300 uL乙腈干燥凝膠片段15分鐘；

11.  用100 uL 100 mmol/L碳酸氫銨溶脹凝膠片段15分鐘；

12.  用300 uL乙腈再次干燥凝膠片段15分鐘；

13.  去除液相，真空干燥凝膠片段15分鐘；

14.  用100 uL賴氨酸內切酶溶液*在冰水浴中溶脹凝膠片段45分鐘；

*賴氨酸內切酶稀釋于50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5；

15.  去除100 uL賴氨酸內切酶溶液，將凝膠片段放在37℃ 10 uL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5中過夜；

16.  加入50 uL 20mmol/L碳酸氫銨20分鐘內振蕩凝膠片段3次抽提多肽；

17.  加入5%甲酸/50%乙腈20分鐘內振蕩凝膠片段3次抽提多肽；

18.  如果需要用Speed Vac.濃縮多肽；

19.  用ZipTip脫鹽和純化多肽；

20.  如果需要用弱真空濃縮多肽至2 uL；

21.  加入基質進行質譜分析。

注意：根據細菌的生理和形態特征分類，產品來源為水解無色桿菌，但是最近細菌分類學將這種細菌鑒定為產酶溶桿菌。

保存：暗處-20℃保存

規格：20 ug×5vial

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產品編號：125-05061