點(diǎn)突變?cè)噭┖?/span>1.0說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時(shí)，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個(gè)和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢(mèng)中國。

產(chǎn)品詳情  

產(chǎn)品描述

本試劑盒可以在質(zhì)粒DNA序列中任意位點(diǎn)引入特定的定突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

首先用高保真DNA聚合酶與帶有突變堿基與硫代修飾的引物，PCR擴(kuò)增野生型質(zhì)粒，將質(zhì)粒線性化并引入突變位點(diǎn)，然后用化學(xué)重組試劑將質(zhì)粒重組成環(huán)狀質(zhì)粒。擴(kuò)增質(zhì)粒的一對(duì)引物各自5'末端的10-12個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)，用于重組環(huán)化質(zhì)粒。將帶有突變堿基的線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物用化學(xué)重組試劑處理環(huán)化質(zhì)粒，然后進(jìn)行DH5a轉(zhuǎn)化，完成基因定點(diǎn)突變。

本公司化學(xué)法突變?cè)噭┖泻懈弑Ｕ?/span>DNA聚合酶2XPCR Mix、化學(xué)重組試劑，可以從頭到尾完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，極大的方便了實(shí)驗(yàn)操作。另有無高保真DNA聚合酶2XPCR Mix的化學(xué)法突變?cè)噭┖小?/span>

產(chǎn)品特點(diǎn)

DNA定點(diǎn)突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

產(chǎn)品組分

使用方法

使用方法

01. 設(shè)計(jì)突變引物

引物設(shè)計(jì)總原則：在正反向擴(kuò)增引物的5'端引入末端互補(bǔ)同源序列，使擴(kuò)增后的線性化質(zhì)粒片段5'和3'末端帶有10-12個(gè)堿基的同源序列，用于重組環(huán)化質(zhì)粒。

l 正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)原則：5'-末端同源序列+突變位點(diǎn)+硫代修飾位點(diǎn)+目標(biāo)序列特異性正向配對(duì)序列-3'

l 反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)原則：5'-末端同源序列+突變位點(diǎn)+硫代修飾位點(diǎn)+目標(biāo)序列特異性反向配對(duì)序列-3'

l 正／反向擴(kuò)增引物與質(zhì)粒模板的特異性配對(duì)序列Tm值55-65℃為佳，末端同源區(qū)序列長度為10-12 個(gè)堿基（一般情況同源區(qū)10個(gè)堿基足以）。

l 一般引物不需PAGE純化，如果最終引物長度超過40 bp，推薦合成時(shí)選用PAGE純化，有助于提高PCR與點(diǎn)突變成功率。

02. 反向PCR擴(kuò)增線性化質(zhì)粒，并引入突變位點(diǎn)

為了防止突變位點(diǎn)之外的堿基額外突變，確保使用高保真聚合酶進(jìn)行反向PCR。50ul的PCR體系中，推薦使用1-5ng 環(huán)狀質(zhì)粒模板。限制性內(nèi)切酶DpnI處理PCR產(chǎn)物，可以降低野生型質(zhì)粒形成的克隆數(shù)。由于本突變?cè)噭┖行矢撸墒÷?/span>DpnI消化處理，對(duì)突變成功率影響不大。

03. 重組環(huán)化反應(yīng)的線性化質(zhì)粒使用量

無需精確計(jì)算化學(xué)法重組反應(yīng)的線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物加入量，一般使用3-5ul。

04. 質(zhì)粒重組環(huán)化反應(yīng)

（1）室溫配制以下反應(yīng)體系：

組分            重組反應(yīng)^a     陰性對(duì)照^b       陽性對(duì)照^c

線性化質(zhì)粒       X μl           X μl              5 μl

化學(xué)重組試劑     2 μl           0 μl              2 μl

ddH₂0         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割膠純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，一定在重組反應(yīng)體系中加入1/10體積的化學(xué)重組Buffer

b. 用來確認(rèn)野生型環(huán)狀質(zhì)粒殘留，推薦進(jìn)行。

c. 突變線性質(zhì)粒DNA陽性對(duì)照反應(yīng)可用來排除其他實(shí)驗(yàn)材料及操作因素的影響。

（2）輕柔混勻后，在70℃反應(yīng)8-10 min，置于室溫或冰上冷卻。

u 在PCR儀及其它加熱儀器上進(jìn)行反應(yīng)，重組環(huán)化效率在反應(yīng)8-10 min左右達(dá)到最高。

u 重組環(huán)化產(chǎn)物可于-20℃存放1個(gè)月，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化即可。

05．重組環(huán)化質(zhì)粒產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

u 在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置15min

u 取5ul重組環(huán)化產(chǎn)物加入到50ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻(請(qǐng)勿振蕩混勻)，冰上靜置15-20 min。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的1/5；

u 42℃水浴熱激1-2min后，立即置于冰上冷卻1- 2 min。

u 加入450 μl SOC或LB培養(yǎng)基(不添加抗生素)，37℃搖菌30min-1h (轉(zhuǎn)速200 - 250 rpm)。

u 將相應(yīng)抗性的LB平板固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱30min（可省略）。

u 直接吸取20-100ul菌液到含有正確抗性的平板上，用無菌涂布棒涂勻。

37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 - 16 h。

06．點(diǎn)突變測序鑒定

u 過夜培養(yǎng)后，重組環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上形成數(shù)百個(gè)單克隆，而不加化學(xué)重組試劑的陰性對(duì)照反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上的克隆數(shù)應(yīng)顯著少于前者。

u 挑取重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上2-3個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列測定，驗(yàn)證是否突變成功。

注意事項(xiàng)

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作！

本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

運(yùn)輸及保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期2年。